El retablo mayor, renacentista, de madera de nogal sin policromar, fue realizado por Francisco Moure, su hijo y discípulos y está dedicado a la Virgen, advocación del colegio. Consta de banco y tres cuerpos de tres calles separadas por columnas corintias de fustes acanalados torsos.
En el banco se representan las cuatro virtudes cardinales, prudencia, justicia, fortaleza y templanza, flanqueando dos a dos el escudo del cardenal y los cuatro Evangelistas, con un gran ostensorio central que también ocupa el cuerpo bajo, que en las calles laterales presenta las escenas en relieve de la Circuncisión y la Epifanía.
El segundo cuerpo presenta una escultura de bulto de la Virgen de la Antigua central con las escenas laterales de la Visitación y la Adoración de los pastores.
En el tercer cuerpo aparece san Ignacio de Loyola en el centro en bulto redondo con las escenas de la Natividad de la Virgen y la Anunciación. El conjunto se remata con dos grandes escudos del cardenal laterales y otro central más grande que está vacío pero que debió de contar con el emblema de los jesuitas.
En el muro del Evangelio del presbiterio, en una hornacina de medio punto flanqueada por pares de pilastras jónicas, se ubica la sepultura de don Rodrigo de Castro con la escultura orante de bronce del fundador, encargada por el propio cardenal a Giambologna, la única escultura del escultor francés afincado en Florencia en España. Debajo está su sepulcro. En el muro de la Epístola hay una pintura de la Virgen de la Antigua que el cardenal tenía en su oratorio del palacio episcopal de Sevilla y que es una réplica de la original venerada en la catedral hispalense.
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